• <abbr id="oqiqs"></abbr>
  • <li id="oqiqs"><dl id="oqiqs"></dl></li><code id="oqiqs"></code>
  • <code id="oqiqs"></code>
  • 技術(shù)文章您現(xiàn)在的位置:首頁 > 技術(shù)文章 > 核酸探針標(biāo)記的實驗過程
    核酸探針標(biāo)記的實驗過程
    更新時間:2015-10-14   點擊次數(shù):910次

    實驗原理

        分子生物研究中,zui常用的探針即為雙鏈DNA探針,它廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物拷貝數(shù)的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機(jī)引物合成法。

        切口平移法(nick translation) 當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補(bǔ)上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸,將放射性同位素?fù)饺氲胶铣尚骆溨小ui合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響: (a) 產(chǎn)物的比活性取決于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b) DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶Ⅰ的質(zhì)量會影響產(chǎn)物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA。

    實驗試劑

    (1) 10×切口平移緩沖液:  0.5M/L Tris-Cl (pH7.2);  0.1M/L MgSO4; 10mM/L DTT;  100ug/ml BSA。ELISA試劑盒

    (2) 未標(biāo)記的dNTP原液:除同位素標(biāo)記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3種分別溶解于50mM/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,濃度為0.3mM/L。

    (3) [α-32P] dCTP或[α-32P]dATP:400 Ci/mM, 10uCi/ul。

    (4)E.coli DNA聚合酶Ⅰ:(4單位/ul):溶于50ug/ml BSA, 1mM/L DTT, 50%甘油,50mM/L Tris·Cl(pH7.5)中。

    (5) DNA酶:1mg/ml。

    (6) EDTA :200mM/L (pH8.0)。

    (7) 10M/L NH4Ac。

    實驗步驟

    (1) 按下列配比混合:

    未標(biāo)記的dNTP 10ul

    10×切口平移緩沖液 5ul

    待標(biāo)記的DNA 1ug

    [α-32 P]dCTP或dATP(70uCi) 7ul

    E.coli DNA聚合酶 4單位

    DAN酶 I 1ul

    加水至終體積 50ul

    (2) 置于15℃水浴60分鐘。

    (3) 加入5ul EDTA終止反應(yīng)。ELISA試劑盒

    (4) 反應(yīng)液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5M/L, 加入兩倍體積預(yù)冷無水乙醇沉淀回收DNA探針。

    注意事項

    1、3H,32P及35S標(biāo)記的dNTP都可使用于探針標(biāo)記,但通常使用[α-32 P]-dNTP。

    2、DNA酶Ⅰ的活性不同,所得到的探針比活性也不同,DNA酶Ⅰ活性高,則所得探針比活性高,但長度比較短。ELISA試劑盒

     

    化工儀器網(wǎng)

    推薦收藏該企業(yè)網(wǎng)站
    主站蜘蛛池模板: 欧美高清性XXXXHDVIDEOSEX| 2021韩国三级理论电影网站| 亚洲日韩精品欧美一区二区| 免费看一级做a爰片久久| 男人的天堂色偷偷之色偷偷| 欧美人与动性行为另类| 性高湖久久久久久久久aaaaa| 国产免费AV片无码永久免费| 日韩在线一区二区三区免费视频| 性色AV无码中文AV有码VR| 亚洲精品99久久久久中文字幕| 外国女性用一对父子精液生子引争议| youjizz欧美| 亚洲欧美强伦一区二区另类| 激情捆绑国语对白| 三上悠亚精品一区二区久久| 国产精品青草久久久久福利99| 双性h啪啪樱桃动漫直接观看| 福利一区二区视频| 日韩美女中文字幕| 一区二区高清视频在线观看| 成人羞羞视频国产| 亚洲第一福利视频| 欧美一级看片免费观看视频在线| 亚洲欧美中文字幕在线网站| 中文字幕一区二区三区日韩精品| 久久久精品中文字幕麻豆发布| 香蕉网在线播放| 精品精品国产自在香蕉网| 午夜网站在线观看免费网址免费| 噼里啪啦完整高清观看视频| 欧美yw193.c㎝在线观看| 91麻豆国产在线观看| 56prom在线精品国产| 无码人妻一区二区三区免费看| 亚洲精品人成无码中文毛片| 激情内射日本一区二区三区| 一本久到久久亚洲综合| 波多野结衣免费一区视频| 国产高清在线看| 久久精品卫校国产小美女|